前言

臨床實(shí)驗(yàn)室使用瓊脂糖或醋酸纖維凝膠進(jìn)行血清蛋白電泳（SPE）檢測[1]，作為免疫球蛋白篩查方法之一，所需血清標(biāo)本量較少、檢測速度快。免疫固定電泳是對是血清區(qū)帶電泳與免疫沉淀反應(yīng)相結(jié)合的定性實(shí)驗(yàn)，屬于免疫球蛋白鑒別的一種方法。它將抗血清直接加在電泳后的蛋白質(zhì)表面，抗原抗體在凝膠中直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，然后在適當(dāng)位置形成抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)染色后可以對各類免疫球蛋白及其輕鏈進(jìn)行分型。

免疫固定電泳（IFE）是鑒定單克隆免疫球蛋白（M蛋白）的金標(biāo)準(zhǔn)[2]，能分類和鑒定SPE檢測到的可疑M蛋白。SPE檢測M蛋白特異性較好，靈敏度較差。M蛋白主要出現(xiàn)在血清蛋白電泳的γ區(qū)，其次是β區(qū)、β-γ交界區(qū)，其中β區(qū)的M蛋白以免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）型為主[3]。

與IFE相比，前者容易漏檢輕鏈型及不同克隆型來源的M蛋白，因此可作為輔助篩查M蛋白的方法之一[4] 。在IFE各條帶類型中，IgG與IgM型條帶多在γ球蛋白區(qū)帶，IgA型條帶多在β與β-γ球蛋白區(qū)帶。IgA型單克隆免疫球蛋白通常向β球蛋白區(qū)帶處遷移，與該區(qū)帶中的非球蛋白成分如轉(zhuǎn)鐵蛋白、C反應(yīng)蛋白、等形成共遷移現(xiàn)象[5]。

案例經(jīng)過

患者，男性，78歲，以“尿蛋白增多3年，雙眼瞼水腫1月”為主訴入院。3年前患者無明顯誘因出現(xiàn)中度蛋白尿增多，伴乏力,無咳嗽、咳痰、胸痛、雙下肢浮腫等其他不適，1月前患者無明顯誘因出現(xiàn)雙眼瞼水腫，尿量減少(具體尿量不詳)，尿中泡沫增多，無雙下肢水腫,無胸悶、氣喘，無尿頻、尿急、尿痛等。高血壓病史5年，平素規(guī)律口服“纈沙坦膠囊80mg/日”。血壓控制在130-150/100-80mmHg左右。

體格檢查：正常面容，皮膚黏膜未見出血點(diǎn)，眼瞼水腫，雙肺叩擊音清，未聞及干濕啰音，胸骨無叩痛，心率72次/分，律齊，未聞及雜音，腹軟，無壓痛反跳痛，雙下肢無水腫。神經(jīng)系統(tǒng)檢查未見異常。

實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果：

1、血生化結(jié)果，如圖1。

圖1

2、隨機(jī)尿生化結(jié)果，如圖2。

圖2

3、24小時(shí)尿生化結(jié)果，如圖3。

圖3

4、血常規(guī)結(jié)果，如圖4。

圖4

5、血免疫固定電泳（IFE）：IgA Kappa型，如圖5。

圖5

6. 血清蛋白電泳（SPEP）結(jié)果：

圖6

7、尿本周蛋白檢測結(jié)果：l輕鏈、l游離輕鏈泳道發(fā)現(xiàn)異常單克隆條帶，尿本周氏蛋白陽性，類型為l游離輕鏈型。

8、血清游離輕鏈定量（FLC）檢測結(jié)果：血清游離輕鏈-k：21.60mg/L,血清游離輕鏈-l:1290.00mg/L，血清游離輕鏈-k/l為0.02,提示單克隆丙種球蛋白，伴隨骨髓抑制。

9、骨髓活檢:流式細(xì)胞檢查：PC門細(xì)胞占有核細(xì)胞的2.01%,表達(dá)CD38、CD138、cLambda、BCMA，部分表達(dá)CD117、CD56、CD27，不表達(dá)cKappa、CD81、CD19，為Lambda單克隆異常表型漿細(xì)胞。BCMA陽性細(xì)胞占有核細(xì)胞的88.38%。

10、鏡下可見骨髓增生減低(10%)，脂肪組織明顯增多，部分區(qū)域可見一類細(xì)胞增多。組化染色:網(wǎng)狀纖維染色(NF-0級).免疫組化:CD38(散在及小簇)，CD138(散在及小簇)，Kappa(-),Lambda(+)，CD20(-)，CD56(-),CD53(-)。

臨床診斷：結(jié)合以上考慮Lambda單克隆細(xì)胞增多(約占有核細(xì)胞10%)。

案例分析

問題1、血清蛋白電泳和免疫固定電泳的結(jié)果不相符，血清蛋白電泳結(jié)果陰性而免疫固定電泳結(jié)果陽性。

結(jié)果分析：由于IgA型M區(qū)帶(特別是濃度不是很高的患者,或經(jīng)治療后的患者掃描峰型)較IgG、IgA、IgM型及高值IgA型M成分比較有峰低底寬且與β、a?成分重疊而出現(xiàn)不典型M帶等特點(diǎn)易漏診[6]。 

在翟洪順等[7]的相關(guān)研究中，44例MM患者在血清蛋白電泳的檢測中有39例出現(xiàn)M蛋白帶，5例未出現(xiàn)蛋白帶（包括3例輕鏈型及2例IgA型MM）。92％以上的多發(fā)性骨髓瘤（MM）患者在血和（或）尿免疫固定電泳中出現(xiàn)M蛋白的條帶[8]，由此可見該患者血清蛋白電泳未出現(xiàn)M蛋白組分也可以理解。

問題2、在血清游離輕鏈-l高達(dá)1290.OOmg/L時(shí)，血清蛋白電泳、免疫固定電泳均未檢測出。

問題出在哪里?為了找到原因，將標(biāo)本送到兄弟醫(yī)院進(jìn)行檢測比對，結(jié)果如圖7。同時(shí)為了避免第一次做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候抗體加錯(cuò)和血清抗原-抗體濃度比例不合適導(dǎo)致抗原抗體復(fù)合物不牢固現(xiàn)象，將原血清復(fù)融重新做了兩次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖8和圖9。

圖7

圖8

圖9

結(jié)果分析：經(jīng)過查詢文獻(xiàn)，SPEP檢測下限為0.3~0.5 g/L；血IFE可檢出血中高于0.2 g/L的M蛋白，而尿IFE可檢出尿中低至0.04 g/L的M蛋白；FLC檢測靈敏度為0.01~0.03g/L[9]。理論上，病人血清中的游離輕鏈結(jié)果是血IFE檢測下限的6倍左右，是SPEP檢測下限的2.6-4倍左右，二者均應(yīng)該可以檢測出來。通過圖7、圖8和圖9的比對，很有可能是抗血清試劑出現(xiàn)了問題。

問題3：抗血清試劑是不是真的出了問題？接下來需要排除試劑的質(zhì)量問題。

通過觀察當(dāng)天其他標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如圖10，和第二天其他標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如圖11。

圖10

圖11

結(jié)果分析：通過觀察圖10和圖11，說明試劑的質(zhì)量是沒有問題的。

再來分析不同試劑的成分。不同廠家的抗血清試劑可能抗體和輕鏈結(jié)合的部位不一樣。我們實(shí)驗(yàn)室使用的是美國海倫娜的試劑（SP泳道3倍稀釋，其他泳道5倍稀釋），而兄弟醫(yī)院使用的是法國賽比亞的試劑（IgG泳道3倍稀釋，其他泳道6倍稀釋）。

前者的抗血清成分是含有單克隆抗人免疫球蛋白IgG，lgA，IgM重鏈，Kappa輕鏈和Lambda輕鏈的抗體；抗血清源自山羊和綿羊[10]。所有抗體均含有疊氮鈉作為保護(hù)劑[9]。后者抗血清的成分是哺乳動(dòng)物免疫球蛋白抗人γ重鏈、α重鏈、μ重鏈，抗人免疫球蛋白抗人k（自由和結(jié)合）輕鏈、l（自由和結(jié)合）輕鏈[11]。

血清總輕鏈檢測位點(diǎn)是輕鏈與重鏈結(jié)合的外側(cè)暴露位點(diǎn)，血清游離輕鏈檢測的是輕鏈內(nèi)側(cè)的隱藏位點(diǎn)，當(dāng)輕鏈游離出來才能被檢出。

綜合以上分析，之所以本實(shí)驗(yàn)室未檢測出，很有可能是病人體內(nèi)產(chǎn)生的游離Lambda輕鏈內(nèi)側(cè)的隱藏位點(diǎn)不能和本實(shí)驗(yàn)室的抗血清結(jié)合導(dǎo)致的。

知識擴(kuò)展

M蛋白是單克隆漿細(xì)胞惡性增殖產(chǎn)生的均一蛋白，見于一組疾病，包括意義不明的單克隆丙種球蛋白病（良性單克隆丙種球蛋白病）、多發(fā)性骨髓瘤、骨孤立性漿細(xì)胞瘤或髓外漿細(xì)胞瘤、巨球蛋白血癥、淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病和原發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變病等[18]。

高濃度的M蛋白可能預(yù)示疾病發(fā)展的進(jìn)程加快，更易于通過SPE篩選發(fā)現(xiàn)[5]。有臨床意義的單克隆免疫球蛋白血癥（monoclonal gammopathies of clinical significance, MGCS）是一組以血或尿中存在單克隆免疫球蛋白（M蛋白）及其所造成的器官損害為主要臨床特征的疾病[15]。

MGCS的疾病譜非常廣泛、疾病表現(xiàn)多樣，臨床表現(xiàn)高度異質(zhì)性，而且大多為少見/罕見疾病，因此容易被漏診和誤診[15]。所以，在臨床應(yīng)用中應(yīng)聯(lián)合多種方法進(jìn)行M蛋白的定性及定量檢測[15]。

總    結(jié)

SPE檢測M蛋白特異性較好，靈敏度較差。與IFE相比，前者容易漏檢輕鏈型及不同克隆型來源的M蛋白，因此可作為輔助篩查M蛋白的方法之一[12]。

IFE其特點(diǎn)是非常有效的聯(lián)合了電泳技術(shù)的分離作用和免疫蛋白特異性的生物學(xué)特性，從而將兩者相結(jié)合，大大提高了檢測的陽性率[13]。1976年IFE被確定為抗體的檢測方法，被應(yīng)用于免疫球蛋白及M蛋白的分型研究[14]。

血清游離輕鏈（FLC）一般采用免疫散射比濁法檢測[15]。通過可特異性結(jié)合FLC的針對免疫球蛋白輕鏈結(jié)合面表位的抗體，可進(jìn)行極低濃度的FLC檢測；并通過計(jì)算游離κ和游離λ的比值判讀出輕鏈的克隆性。

血清游離κ/λ比值的正常值為0.26~1.65，超過1.65代表存在單克隆κ型輕鏈；低于0.26則代表存在單克隆λ型輕鏈。其檢測靈敏度（10~30 mg/L）較SPEP和IFE進(jìn)一步提高，可以對微量M蛋白進(jìn)行定量監(jiān)測[16]。血清游離輕鏈（serum free light chain，sFLC）是篩查MM及相關(guān)漿細(xì)胞疾病時(shí)靈敏度較高的指標(biāo)，sFLC檢測還有助于對輕鏈淀粉樣變性和輕鏈型MM患者進(jìn)行定量監(jiān)測和療效判斷[17]。

血清蛋白電泳（SPEP）、血/尿免疫固定電泳（IFE）及血清游離輕鏈（FLC）比值、重輕鏈（HLC）比值都可用于檢測患者是否存在M蛋白。每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中應(yīng)聯(lián)合上述多種方法進(jìn)行M蛋白的定性及定量檢測[15]。所以，臨床醫(yī)生可根據(jù)病人的試劑需要對不同的項(xiàng)目進(jìn)行組合檢測，這也需要檢驗(yàn)科和臨床保持密切的溝通。另外，不同資歷的工作人員可能對可疑M蛋白的判讀有不一致的結(jié)果，需要工作人員提高自身的專業(yè)知識，且對患者的臨床背景作全面的了解[5]。

國賽M蛋白檢測解決方案

國賽Omlipo及Aristo系列特定蛋白分析儀可用于FLC的檢測，儀器性能穩(wěn)定，自動(dòng)化程度高，采用經(jīng)典免疫散射比濁法，準(zhǔn)確性高。

國賽FLC檢測優(yōu)勢：

（1）靈敏度高，可達(dá)3mg/L；

（2）高性能抗體能有效識別多個(gè)免疫球蛋白輕鏈抗原隱藏結(jié)合表位，避免漏診；

（3）抗原過剩自動(dòng)稀釋重測，可準(zhǔn)確地檢測出高值樣本，避免鉤狀效應(yīng)，更好地滿足臨床需求。

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作者：梁利芳 趙賀紅 張崢

單位：開封市人民醫(yī)院

轉(zhuǎn)載：檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)